植物激素脫落酸（ABA）ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)

預期應用
ELISA法定量測定植物植物組織、細胞或其它相關(guān)樣本中ABA含量。
 
實(shí)驗原理
用純化的ABA抗體包被微孔板，制成固相載體，往微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的ABA抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過(guò)*洗滌后用底物（TMB）顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的。顏色的深淺和樣品中的ABA呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長(cháng)下測定吸光度（ 值），計算樣品濃度。
 
試劑盒組成及試劑配制
1、 酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為100 nmol/ml，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?，分別配制成100 nmol/ml，50 nmol/ml，25 nmol/ml，12.5 nmol/ml，6.25 nmol/ml，3.12 nmol/ml，1.56 nmol/ml，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 nmol/ml。如配制50 nmol/ml標準品：取0.5ml （不要少于0.5ml ）100 nmol/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
6、 檢測溶液A：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋?zhuān)ㄈ纾?0 檢測溶液A / 990 檢測稀釋液A），充分混勻，稀釋前根據預先計算好的每次實(shí)驗所需的總量配制（100 /孔），實(shí)際配制時(shí)應多配制  0.1-0.2ml。
7、 檢測溶液B：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
8、 底物溶液：1×10ml/瓶。
9、 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10、終止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H2SO4）。
11、覆膜：5張
12、使用說(shuō)明書(shū)：1份
 
 
 
自備物品
1、 酶標儀（建議儀器使用前提前預熱）
2、 微量加液器及吸頭，EP管
3、 蒸餾水或去離子水，濾紙
 
植物標本的采集及保存

1、 新鮮植物組織請在液氮中充分研磨；

2、 加入樣品體積3倍的提取液（10% TCA）, 置于-20 過(guò)夜；

3、 請于4 ，8000rpm，離心1小時(shí)，棄上清，收集沉淀；

4、 沉淀加入等體積的冰浴丙酮，混勻后于4 離心（8000rpm，15分鐘），棄上清并真空干燥，保存備用；

5、 上樣前加入裂解液（2.7g 尿素，0.2g CHAPS，溶于去離子水中至終體積5ml），混勻后室溫放置30分鐘，然后4 離心（8000rpm，15分鐘），取上清并暫時(shí)保存于4 待用。
注：以上標本均應密封保存，4 保存應小于1周，-20 不應超過(guò)1個(gè)月，-80 不應超過(guò)2個(gè)月；
 
操作步驟
實(shí)驗開(kāi)始前，各試劑均應平衡至室溫，試劑不能直接在37 溶解；試劑或樣品配制時(shí)，均需充分混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。實(shí)驗前應預測樣品含量，如樣品濃度過(guò)高時(shí)，應對樣品進(jìn)行稀釋?zhuān)允瓜♂尯蟮臉悠贩显噭┖械臋z測范圍，計算時(shí)再乘以相應的稀釋倍數。
1、 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?100 ，余孔分別加標準品或待測樣品100 ，注意不要有氣泡，加樣 時(shí)將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37 溫育2小時(shí)。為保證實(shí)驗結果有效
性，每次實(shí)驗請使用新的標準品溶液。
2、 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100 （臨用前配制），酶標板加上覆膜，37 溫育1小時(shí)。
3、 棄去孔內液體，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400 /每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）。
4、 每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100 ，加上覆膜，37 溫育1小時(shí)。
5、 棄去孔內液體，甩干，洗板5次，方法同步驟3。
6、 每孔加底物溶液90 ，酶標板加上覆膜37 避光顯色（反應時(shí)間控制在15-30分鐘，當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯時(shí)，即可終止）。
7、 每孔加終止溶液50 ，終止反應，此時(shí)藍色立轉。終止液的加入順序應盡量與底物    液的加入順序相同。
8、 立即用酶標儀在450nm波長(cháng)測量各孔的光密度（ 值）。
 
注：
1、 試劑準備：所有試劑在使用前應平衡至室溫，使用后請立即按照說(shuō)明書(shū)要求保存試劑。實(shí)驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。
2、 加樣：加樣或加試劑時(shí)，*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會(huì )導致不同的 “預溫育”時(shí)間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。一次加樣時(shí)間（包括標準品及所有樣品）控制在10分鐘內。推薦設置復孔進(jìn)行實(shí)驗。
3、 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗時(shí)將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應盡快進(jìn)行下步操作，任何時(shí)侯都應避免酶標板處于干燥狀態(tài)；同時(shí)應嚴格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。
4、 洗滌：洗滌過(guò)程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標儀讀數。
5、 試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時(shí)離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據所需的量配制使用，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆。請配制標準品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A時(shí)，一次不要小于10 ），以避免由于不準確稀  釋而造成濃度誤差；請勿重復使用已稀釋過(guò)的標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液。
6、 反應時(shí)間的控制：加入底物后請定時(shí)觀(guān)察反應孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請提前加入終止液終止反應，避免反應過(guò)強從而影響酶標儀光密度讀數。
7、 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時(shí)避免強光直接照射。
    
洗板方法
1、 手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內，浸泡1-2分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體，在實(shí)驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；根據需要，重復此過(guò)程數次。
2、 自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機，應在熟練使用后再用到正式實(shí)驗過(guò)程中。
 
特異性
    本試劑盒可同時(shí)檢測重組或天然的植物ABA，且與其它相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應。
 
計算
  各標準品及樣本 值扣除空白孔 值后作圖（七點(diǎn)圖），如設置復孔，則 應取其平均值計算。以標準品的濃度為縱坐標（對數坐標）， 值為橫坐標（對數坐標），在對數坐標紙上繪出標準曲線(xiàn)。推薦使用專(zhuān)業(yè)制作曲線(xiàn)軟件進(jìn)行分析，如 curve expert 1.3，根據樣品 值，由標準曲線(xiàn)查出相應的濃度，乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與 值計算出標準曲線(xiàn)的回歸方程式，將樣品的 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實(shí)際濃度。
 
檢測范圍： 1.56 nmol/ml - 100 nmol/ml，繪制標準曲線(xiàn)請取用以下濃度值：100 nmol/ml，50 nmol/ml，25 nmol/ml，12.5 nmol/ml，6.25 nmol/ml，3.12 nmol/ml，1.56 nmol/ml。
 
zui低檢測限：0.39 nmol/ml
 
ELISA試劑盒