人組胺（HIS）ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)

預期應用
ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中組胺（HIS）含量。
 
實(shí)驗原理
用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗HIS抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗HIS抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過(guò)*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的。顏色的深淺和樣品中的HIS呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長(cháng)下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
 
試劑盒組成及試劑配制
1.        酶聯(lián)板：一塊（96孔）
2.        標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 ng/ml，將其稀釋為100 ng/ml后，再做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?，分別稀釋100 ng/ml，50 ng/ml，25 ng/ml，12.5 ng/ml，6.25 ng/ml，3.12 ng/ml，1.56 ng/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/ml，臨用前15分鐘內配制。如配制50 ng/ml標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）100 ng/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3.        樣品稀釋液：1×20ml。
4.        檢測稀釋液A：1×10ml。
5.        檢測稀釋液B：1×10ml。
6.        檢測溶液A：1×120μl（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋?zhuān)♂屒案鶕A先計算好的每次實(shí)驗所需的總量配制（100μl/孔），實(shí)際配制時(shí)應多配制0.1-0.2ml。如10μl檢測溶液A加990μl檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內配制。
7.        檢測溶液B：1×120μl/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
8.        底物溶液：1×10ml/瓶。
9.        濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10.    終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
11.    覆膜：5張
12.    使用說(shuō)明書(shū)：1份
 
自備物品
1.   酶標儀（建議參考儀器使用說(shuō)明提前預熱）
2.   微量加液器及吸頭，EP管
3.   蒸餾水或去離子水，全新濾紙
 
標本的采集及保存
1.        血清：全血標本請于室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2.        血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3.        其它生物標本：請1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
注：以上標本置4℃保存應小于1周，-20℃或-80℃均應密封保存，-20℃不應超過(guò)1個(gè)月，-80℃不應超過(guò)2個(gè)月；標本溶血會(huì )影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進(jìn)行此項檢測。
 
操作步驟
實(shí)驗開(kāi)始前，各試劑均應平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）；試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。實(shí)驗前應預測樣品含量，如樣品濃度過(guò)高時(shí)，應對樣品進(jìn)行稀釋?zhuān)允瓜♂尯蟮臉悠贩显噭┖械臋z測范圍，計算時(shí)再乘以相應的稀釋倍數。
1.        加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。為保證實(shí)驗結果有效性，每次實(shí)驗請使用新的標準品溶液。
2.        棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100μl（在使用前一小時(shí)內配制），酶標板加上覆膜, 37℃反應60分鐘。
3.        溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）。
4.        每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100μl，酶標板加上覆膜37℃反應60分鐘。
5.        溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）。
6.        依序每孔加底物溶液90μl，酶標板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內，此時(shí)肉眼可見(jiàn)標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。
7.        依序每孔加終止溶液50μl，終止反應，此時(shí)藍色立轉。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗結果的準確性，底物反應時(shí)間到后應盡快加入終止液。
8.        用酶聯(lián)儀在450nm波長(cháng)依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后立即進(jìn)行檢測。
 
注：
1.  試劑準備：所有試劑都必須在使用前達到室溫，使用后請立即按照說(shuō)明書(shū)要求保存試劑。  實(shí)驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。
2.   加樣：加樣或加試劑時(shí)，請注意在吸取標本 / 標準品，酶結合物或底物時(shí)，*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會(huì )導致不同的 “預孵育”時(shí)間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。一次加樣時(shí)間（包括標準品及所有樣品）控制在10分鐘內，如標本數量多，推薦使用多道移液器加樣。
3.   孵育：為防止樣品蒸發(fā)，試驗時(shí)將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應盡快進(jìn)行下步操作，任何時(shí)侯都應避免酶標板處于干燥狀態(tài);同時(shí)應嚴格遵守給定的孵育時(shí)間和溫度。
4.   洗滌：洗滌過(guò)程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上充分拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標儀讀數。
5.  試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時(shí)離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據所需的量配置使用，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆。請配置標準品及工作液，盡量不要微量配置（如吸取檢測溶液A時(shí)，一次不要小于10μl），以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差；請勿重復使用已稀釋過(guò)的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
6.  反應時(shí)間的控制：加入底物后請定時(shí)觀(guān)察反應孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請提前加入終止液終止反應，避免反應過(guò)強從而影響酶標儀光密度讀數。
7.  底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時(shí)避免強光直接照射。
    建議檢測樣品時(shí)均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。
    如標本中待測物質(zhì)含量過(guò)高，請先稀釋后再測定，計算時(shí)請zui后乘以稀釋倍數。
 
洗板方法
1.  手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實(shí)驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘，根據需要，重復此過(guò)程數次。
2.  自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機，應在熟練使用后再用到正式實(shí)驗過(guò)程中。
 
特異性
    本試劑盒可同時(shí)檢測重組或天然的人HIS，且與其它相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應。
 
計算
  以標準物的濃度為縱坐標（對數坐標），OD值為橫坐標（對數坐標），在對數坐標紙上繪出標準曲線(xiàn)。推薦使用專(zhuān)業(yè)制作曲線(xiàn)軟件進(jìn)行分析，如curve expert 1.3，根據樣品的OD值由標準曲線(xiàn)查出相應的濃度，再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線(xiàn)的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實(shí)際濃度。
 
檢測范圍：1.56 ng/ml - 100 ng/ml
 
zui低檢測限：0.78 ng/mL
 
說(shuō)明
1.         在儲存及孵育過(guò)程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染，試劑避免受到微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現錯誤的結果。
2.         試劑盒保存：請收到試劑盒后盡快將標準品、檢測溶液A和檢測溶液B保存于-20℃，其余試劑短期保存請置于4℃，長(cháng)期保存則置于-20℃。
3.         濃洗滌液會(huì )有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。
4.         剛開(kāi)啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì )有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F象，不會(huì )對實(shí)驗結果造成任何影響。
5.         所有的樣品都應管理好，按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。
6.         有效期：6個(gè)月。