利用Ion半導體測序開(kāi)展基因表達譜分析

             研究顯示雜交芯片可產(chǎn)生大約兩百萬(wàn)個(gè)已定位的讀取[7]，但也有研究證實(shí)，即使讀取數目過(guò)億，提高讀取數目仍然繼續增加其信息量 那么，究竟Ion PGM™測序儀生成多少個(gè)100 base讀取能相當于一個(gè)基因表達微陣列芯片呢？在白皮書(shū)[9]中我們對Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Arrays （HG-U133 Plus 2.0）的芯片質(zhì)量控制（MAQC）的微陣列數據與Ion PGM™系統生成的RNA-Seq數據進(jìn)行了比較。圖1顯示了Ion PGM™測序儀數據按照不同檢測閾值下所得的基因數和微陣列芯片所能檢測到的基因數。當采用zui嚴謹的檢測閾值即每個(gè)基因≥10讀取時(shí)，兩百萬(wàn)個(gè)來(lái)自Ion PGM™測序儀的已定位讀取所能檢測到的基因數超過(guò)了微陣列芯片能檢測的基因。

             當讀取計數閾值放寬到≥5讀段數/基因時(shí)，僅僅1百萬(wàn)個(gè)Ion RNA-Seq已定位讀取所能檢測到的基因數就超過(guò)了芯片的基因檢測數。利用來(lái)自Ion PGM™測序儀的2百萬(wàn)個(gè)平均讀取所能檢測到的顯著(zhù)差異表達基因數（sig DEGs）要多于微陣列芯片所能檢測到的sig DEGs數。在p ≤0.05和倍數變化f≥2標準下，在HBRR和UHRR樣本中Ion PGM™測序儀得到的sig DEGs數為4,630，而相比之下芯片得到的sig DEGs數為4,198將Ion PGM™測序儀生成的兩百萬(wàn)個(gè)已定位讀取所產(chǎn)生的基因差異表達結果與qPCR結果相比較，發(fā)現qPCR 和RNA-Seq得到的sigDEGs倍數變化的對數值的Pearson相關(guān)系數（R）超過(guò)0.95。

             在Ion PGM™平臺進(jìn)行RNA-Seq實(shí)驗的另一個(gè)優(yōu)勢在于，能夠應用ERCC RNA Spike-In Mix對轉錄本檢測靈敏度進(jìn)行評估。這些ERCC轉錄本混合物是一些含多聚腺苷酸化且無(wú)標記的RNA，該混合物經(jīng)過(guò)美國國家標準技術(shù)研究所（NIST）鑒定，是評估RNA測量系統性能的工具，能控制實(shí)驗可變因素。這些ERCC轉錄本的GC含量經(jīng)過(guò)平衡，更貼近真核生物內源性mRNA的特征，它們的長(cháng)度范圍在250 到2,000個(gè)核苷酸之間。ERCC轉錄本混合物的含量構成經(jīng)特殊設計，能代表一個(gè)大動(dòng)態(tài)范圍的表達水平。ERCC ExFold RNA Spike-In Mix可用于評估基因差異表達的檢測靈敏度。這些質(zhì)控RNA使用戶(hù)得以直接評估文庫質(zhì)量、檢測靈敏度、動(dòng)態(tài)范圍以及表達倍數變化。劑量響應散點(diǎn)圖顯示，ERCC相對濃度的對數值與已定位讀取數的對數值呈線(xiàn)性關(guān)系（圖2）。利用這些外部RNA質(zhì)控有助于將來(lái)自合作實(shí)驗室所產(chǎn)生的結果進(jìn)行直接比較。